一、引言

二、材料與方法

1. 實驗材料準備

• 華貴櫛孔扇貝樣本采集自特定的海洋養(yǎng)殖區(qū)域，選取健康、活力旺盛且處于適宜生長階段的個體。在實驗室中，對扇貝進行暫養(yǎng)，模擬其天然生存環(huán)境，控制水溫、鹽度和光照等條件，確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。

• 構建用于基因編輯的特定質粒，該質粒包含目標基因的編輯序列以及篩選標記基因等關鍵元件。通過基因工程技術，對質粒進行精確設計和合成，保證其質量和純度符合實驗要求。同時，準備高質量的電轉染緩沖液，該緩沖液的配方經(jīng)過多次優(yōu)化，包含適宜濃度的離子成分，以維持細胞的滲透壓平衡和電生理穩(wěn)定性。

2. 電轉染實驗設計

• 采用多因素實驗設計方案，綜合考慮電壓、脈沖時長、質粒濃度以及細胞密度等因素對電轉染效果的影響。設置不同的電壓梯度，范圍從 100 V 到 500 V，以 50 V 為間隔進行分組實驗。脈沖時長設置為 5 ms、10 ms、20 ms 等不同水平。質粒濃度則從 1 μg/mL 到 10 μg/mL 進行梯度變化，細胞密度控制在 1×10? cells/mL 到 5×10? cells/mL 之間。

• 對于每一組實驗條件，將準備好的細胞懸液與質粒溶液按照一定比例混合均勻，然后轉移至特制的電轉染杯中。電轉染杯的電極間距經(jīng)過精確測量和校準，以確保電場分布的均勻性。將電轉染杯置于電轉儀中，按照設定的電壓、脈沖時長等參數(shù)進行電轉染操作。在電轉染過程中，利用儀器自帶的監(jiān)測功能，記錄電流變化曲線，以評估電轉染過程中的電學特性。

3. 基因編輯效率檢測

• 在電轉染完成后，將細胞接種于培養(yǎng)板中，在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一定時間（如 48 小時）。然后，采用分子生物學技術檢測基因編輯效果。提取細胞基因組 DNA，利用特異性引物對目標基因編輯區(qū)域進行 PCR 擴增。通過對 PCR 產物進行測序分析，確定基因編輯的類型和效率。計算發(fā)生基因編輯的細胞數(shù)量占總細胞數(shù)量的比例，以此作為基因編輯效率的評價指標。

• 同時，采用熒光定量 PCR 技術檢測與基因編輯相關基因的表達水平變化，以進一步驗證基因編輯的有效性。通過比較不同實驗條件下基因表達水平的差異，分析電轉染條件對基因編輯后基因表達調控的影響。

4. 細胞存活率測定

• 運用細胞活力檢測試劑盒（如臺盼藍拒染法）測定電轉染后細胞的存活率。將電轉染后的細胞懸液與臺盼藍溶液按照一定比例混合，在顯微鏡下觀察細胞的染色情況。未被染成藍色的細胞為活細胞，統(tǒng)計活細胞數(shù)量與總細胞數(shù)量的比例，即為細胞存活率。

• 另外，采用流式細胞術對細胞的凋亡情況進行分析。通過檢測細胞凋亡相關標志物（如 Annexin V 和碘化丙啶）的表達水平，確定電轉染過程中細胞凋亡的比例，從細胞凋亡的角度評估電轉染條件對細胞的損傷程度。

三、結果與分析

1. 電壓對電轉染效果的影響

• 隨著電壓的升高，基因編輯效率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在較低電壓（如 100 - 200 V）時，由于電場強度較弱，不足以促使質粒有效地穿過細胞膜進入細胞內，導致基因編輯效率較低。當電壓升高到 300 - 400 V 時，基因編輯效率顯著提高，在 350 V 時達到峰值，此時能夠有效地將質粒導入細胞并實現(xiàn)基因編輯。然而，當電壓進一步升高超過 400 V 時，細胞受到的電場損傷加劇，導致細胞存活率大幅下降，進而影響基因編輯效率。例如，在 100 V 時基因編輯效率僅為 5% 左右，而在 350 V 時可達到 30% 左右，但在 500 V 時又下降至 10% 以下。

• 從細胞存活率來看，電壓與細胞存活率呈明顯的負相關關系。在低電壓下，細胞存活率相對較高，可維持在 80% - 90%。隨著電壓的升高，細胞受到的電穿孔損傷逐漸加重，細胞存活率逐漸降低。在 500 V 時，細胞存活率可能僅為 30% - 40%。

2. 脈沖時長的作用

• 脈沖時長對基因編輯效率也有重要影響。較短的脈沖時長（如 5 ms）時，質粒進入細胞的機會相對較少，基因編輯效率較低，一般在 10% - 15%。隨著脈沖時長增加到 10 - 20 ms，基因編輯效率逐漸提高，在 15 ms 時可達到 25% - 30%。這是因為適當延長脈沖時長能夠為質粒提供更多的時間與細胞膜相互作用并進入細胞內。但當脈沖時長過長（如超過 20 ms）時，細胞長時間處于電場作用下，會導致細胞膜修復困難，細胞損傷加重，基因編輯效率反而下降。

• 細胞存活率方面，脈沖時長過長同樣會降低細胞存活率。在 5 ms 脈沖時長時，細胞存活率可高達 85% - 90%，而當脈沖時長為 20 ms 時，細胞存活率可能下降至 60% - 70%。

3. 質粒濃度與細胞密度的影響

• 質粒濃度的增加在一定范圍內能夠提高基因編輯效率。當質粒濃度從 1 μg/mL 增加到 5 μg/mL 時，基因編輯效率逐漸上升，從 10% 左右提高到 20% - 25%。這是由于更多的質粒增加了與細胞接觸并進入細胞的概率。然而，當質粒濃度過高（如超過 5 μg/mL）時，會出現(xiàn)質粒聚集現(xiàn)象，影響其進入細胞的效率，同時可能對細胞產生毒性作用，導致基因編輯效率不再上升甚至下降。

• 細胞密度對基因編輯效率和細胞存活率也有影響。較低的細胞密度（如 1×10? cells/mL）時，細胞間的相互作用相對較少，質粒分布相對均勻，基因編輯效率相對穩(wěn)定在 15% - 20%。隨著細胞密度增加到 3×10? cells/mL - 5×10? cells/mL，細胞間的競爭和相互作用增強，可能影響質粒的攝取和基因編輯效率，同時細胞密度過高也會導致營養(yǎng)物質和空間的競爭加劇，降低細胞存活率。在細胞密度為 5×10? cells/mL 時，細胞存活率可能從低密度時的 80% 左右下降到 50% - 60%。

四、結論與展望